今天跟大家分享一下关于黑曲霉保存方法的问题。以下是这个问题的总结。让我们来看看。
菌种的长期保存方法
1.继代培养保存法:包括斜面培养、刺培养、肉浸培养基培养等。培养后保存在4-6℃的冰箱中。其中，斜面培养法是将菌株接种在合适的固体斜面培养基上。待菌种充分生长后，用油纸包好棉塞，放入2-8℃冰箱保存。储存时间根据微生物的种类而变化。霉菌、放线菌和带孢子的细菌保存2-4个月，移植一次。酵母要每月移植一次，持续两个月。这种方法是实验室和工厂菌种室常用的保存方法。其优点是操作简单，使用方便，不需要特殊设备，能随时检查保存的菌种是否死亡、变异和污染。缺点是容易变异，因为培养基的理化特性不是严格恒定的。反复传代会改变微生物的代谢，影响微生物的特性，有更多的机会污染杂菌。
2.液体石蜡覆盖保存法:液体石蜡覆盖保存法是一种变相的继代培养法，可以适当延长保存时间。用灭菌液体石蜡覆盖斜面培养和刺培养，一方面可以防止细菌因培养基中的水分蒸发而死亡，另一方面可以防止氧气进入，从而减弱代谢。这种方法的原理是用灭菌的液体石蜡覆盖细菌，使细菌与空气体隔离，停止细菌的生长和代谢。同时石蜡油还可以防止水分蒸发，从而达到低温下长时间保存细菌的目的。保存温度应为-4-4℃，液体石蜡法适用于不产生孢子的菌株。该方法实用有效。霉菌、放线菌、子孢子可保存2年以上，酵母可保存1-2年，一般无孢子菌也可保存1年左右。即使是普通方法难以保存的脑膜炎球菌，在37℃的培养箱中也能保存3个月。这种方法的优点是生产简单，不需要特殊设备，不需要频繁移栽。缺点是存放时必须直立放置，占用空间大，不方便携带。培养物从液体石蜡中取出移植后，接种环在火焰上燃烧时，培养物容易与残留的液体石蜡飞溅，应特别注意。
3.载体保藏法:载体保藏法是将微生物吸附在合适的载体上，如土壤、沙子、硅胶、滤纸等，然后干燥的一种保藏方法。比如现在广泛使用的沙子保存法和滤纸保存法。
4.宿主保存法:宿主保存法用于不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次体、螺旋体等。它们必须在活的动物、昆虫和鸡胚中被感染和传递。这种方法相当于一般的微生物传代保存方法。病毒等微生物也可用其他方法保存，如液氮保存、冻干保存等。冷冻保存方法可分为低温冰箱(-20-30℃、-50-80℃)、干冰酒精(约-70℃)和液氮(-196℃)进行速冻。
5.甘油管保存法:甘油管冷冻保存法是利用微生物在甘油中的生长和代谢受到抑制的原理来达到保存的目的。方法是将80%甘油用高压蒸汽灭菌备用。将培养的斜面菌种用无菌水制成高浓度菌悬液。取1ml灭菌甘油，放入菌液中混匀，使甘油浓度约为10%-30%，冷冻于-70℃。-20℃贮存时间短。或者采用体积比为8: 2的甘油-生理盐水，加入新鲜培养的菌体肉汤，混匀，置于-20℃冰箱中保存。这种方法适用于一般细菌的保存，也适用于链球菌、弧菌、真菌等需要特殊保存方法的菌株。适用范围广，操作简单，效果好，无变异。甘油-生理盐水保存液优于甘油原液，可能是由于加入生理盐水适当降低了甘油的高渗效应，肉汤培养适当增加了保存液的营养成分，从而更好地保护了待保存的菌种。
6.冻干保存法:先将微生物在极低温度下(约-70℃)快速冷冻，然后减压升华除去水分(true 空干燥)，其中以true 空冻干法最为常见。True 空冻干保存法是菌种低温、干燥、缺氧保存的主要因素。不适合丝状真菌的菌丝体，但适合病毒、细菌、放线菌、酵母和丝状孢子。不到2%的微生物不适合冻干保存。True 空冻干法是将细胞在低温下快速冷冻，然后在true 空条件下干燥，使微生物的生长和酶的活性停止。为了防止在冷冻和水分升华过程中对细胞的损伤，应使用保护剂来制备细胞悬液，使冷冻和脱水过程中起保护作用的溶质通过氢键和离子键对水和细胞的亲和力来稳定细胞成分的构型。即使样品中的水被冻结，抽真空空空也可以直接将冻结的冰升华成水蒸气，干燥样品。干燥后的微生物在真空空空下封装，隔绝空气体，达到长期保存的目的。
菌种保藏的常用方法和特点
(1)斜面低温保存。这是最常用和最简单的菌种保存方法之一。将待保存的菌种接种在斜面培养基上，在合适的温度下培养。当菌丝在斜面上生长旺盛时，取出试管菌种，保存在4℃冰箱中。特点:
(1)简单易操作，适用于各种蘑菇菌种的保存，是目前生产和科研中广泛使用的方法；②保存时间短，半年需要轮换一次，多次轮换试管菌丝变异的可能性大；(3)若用石蜡纽扣代替胶塞，可保存1 ~ 3年。
(2)液体石蜡保存。液体石蜡保存也叫矿物油保存，是一种用矿物油覆盖试管斜面的试管保存方法。矿物油是指无色透明、粘稠稳定、不易被微生物分解的石蜡油和液体石蜡油。将其覆盖在斜面菌种上，可以隔绝空气体，防止培养基中水分蒸发，抑制微生物代谢活性，延缓细胞衰老，从而达到菌种长期保存的目的。特点:
①方法简单，保存条件不严格，保存时间长，可作为菌种长期保存的方法；②菌种必须垂直放置，不方便。
(3)滤纸保存。滤纸保存法是以无菌滤纸为吸附载体，长期保存食用菌孢子的一种方法，又称滤纸孢子保存法。特点:技术要求高，设备成本高，菌种不易老化降解，保存时间长，变异小。
(4)自然基质保存。天然基质保藏法是利用无毒、无刺激、无抑菌、营养丰富的天然生长基质作为培养基来保藏菌种的方法。食用菌常用的天然基质有很多，如发酵粪草、木屑、树枝基质等。材料易得，制备方法简单，保存时间长。使用时，只需取一片、一粒或一条培养物，放在新鲜的培养基上，在适当的温度下培养即可。特点:方法简单易操作，保存时间长。
菌种保存的目的和方法是什么？
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回答
1.目的:尽可能保持菌株原有性状和活力的稳定，确保菌株不死亡、不变异、不被异物污染，保持菌株优良性状不退化、优良菌株不成活。2.原理:通过降低微生物在体内的代谢，抑制生长繁殖，可以延长菌株的寿命，减少变异。常用的方法有低温保存、缺氧保存和干燥保存。
一、菌种保藏的目的
1.目的
菌种在使用和继代培养过程中，容易污染、变异和死亡，导致菌种衰退和优良菌种流失。菌种保藏的目的是尽可能保持菌种原有的特性和活力稳定，保证菌种不死亡、不变异、不被异物污染，保持菌种的优良特性和存活。
2.原则
菌种保藏的原理是减少微生物的新陈代谢，抑制生长繁殖，从而延长菌种寿命，减少变异。常用的方法主要有低温保存、缺氧保存和干燥保存。避光、加保护剂、缺营养也能提高保鲜效果。
二、菌种保存的方法有哪些？
1、斜坡低温保存法
将菌种接种在合适的固体斜面培养基上，待菌种完全生长时，用油纸包好棉塞，然后转移到2-8℃的冰箱中保存。
2、液体石蜡保存方法
(1)在三角瓶中装满液体石蜡，用棉塞塞紧，用牛皮纸包好，在0.1MPa，121.3℃灭菌30分钟左右，然后转移到40℃的培养箱中，蒸发水蒸气。
(2)将菌株在斜面培养基中培养，获得健壮的菌体，然后用无菌吸管将石蜡注入斜面，用量高于斜面顶部1cm。
(3)保持试管直立，低温或室温保存。
3、滤纸保存方法
(1)准备滤纸条(0.5×1.2cm)，放入安瓿(0.6×8cm)中，每管放1-2片，然后放入棉塞，在0.1MPa，121.3℃下灭菌30分钟。
(2)将菌种在斜面培养基中培养，得到健壮的菌体，然后取出1-2ml灭菌脱脂乳，滴入灭菌培养皿中，将几种环孢菌素均匀混合在乳中，制成浓缩悬液。
(3)用镊子取出滤纸条，浸入菌悬液中，充分吸收后放回安瓿管中，用棉塞塞紧。
(4)将安瓿管放入装有五氧化二磷的干燥器中，用真空泵抽干。然后将棉花装入管中，用火焰密封，低温保存。
(5)需要使用菌种时，将安瓿口放在火焰上加热，在加热部位滴一滴冷水打碎玻璃，然后用镊子将瓶口处的玻璃敲掉。安瓿管打开后，取出滤纸，放入液体培养基中，放入培养箱中培养。
4、砂子保存方法
(1)取出河沙，加入10%的稀盐酸，加热煮沸30分钟(去除有机物)。
(2)倒掉酸水，用自来水冲洗河沙至中性，然后晾干，过40目筛，去除粗颗粒。
(3)取免耕层中不含腐殖质的薄黄土或红壤，多次浸泡至中性。
(4)干燥、粉碎、过筛(100目筛)除去粗颗粒。
(5)将沙和土按2:1的比例混合，放入试管中，放上棉塞，灭菌30分钟左右。
(6)在斜面培养基中培养菌株，获得健壮的菌体，然后向斜面培养物中注入3-5ml无菌水，洗去细胞或孢子，制成菌悬液。
(7)用无菌吸管吸取菌悬液，均匀滴入沙管中，每管0.2-0.5ml，然后真空将管中的水抽出。如果涉及放线菌和霉菌，可以直接挑孢子混在沙管里。
(8)砂管用火焰密封，低温(4-6℃)存放在干燥处，或直接用牛皮纸或塑料纸包裹，存放在干燥器中。在保存过程中，每半年需要检查菌株的生存力和纯度。
5、甘油管保存方法
(1) 80%甘油用高压蒸汽灭菌。
(2)在斜面培养基上培养菌株，然后用无菌水制备高浓度菌悬液。
(3)将1毫升甘油与菌液混合均匀，使甘油浓度约为10-30%，然后保存在零下70℃的环境中冷冻。
(4)也可使用甘油-生理盐水(体积比:8:2)，与细菌肉汤混合均匀后保存于-20℃。..
6、冻干保存法
(1)低温快速冷冻细胞，然后在true 空条件下干燥。同时，为了保证细胞在冷冻和水分升华过程中不被破坏，要使用保护剂来制备细胞悬液(冷冻和脱水过程中保护细菌的溶质)，通过氢键和离子键对水和细胞的亲和力来稳定细胞成分的构型。
(2)干燥后的菌种在true 空下包装，隔绝空气体，实现长期保存。
(3)这种方法具有菌种保存的三个主要因素:低温、干燥和缺氧，适用于除丝状真菌菌丝体以外的所有微生物。
微生物菌种的保存方法有哪些？
菌种质量是食用菌生产成败的关键。菌种是国家重要的生物资源，是微生物工厂的主要生产资料。由于微生物繁殖快、易变异，微生物菌种需要妥善保存。世界各国都非常重视微生物菌种。中国科学院微生物研究所专门成立了菌种保藏机构，为各生产单位收集和供应各种优良菌种。当然，就具体生产单位而言，大量的生产用菌种还得自己生产和保藏。
菌种保藏的目的是长期保持菌种的优良特性、生活力和纯度，降低菌种的衰退速度，保证菌种的纯度，防止杂菌的污染和灭绝。
菌种保藏方法:人们在长期的生产实践中积累了大量菌种保藏的经验。常用的保存方法有:斜坡低温保存、液体石蜡保存、沙管保存、滤纸保存、谷物保存等。常用的菌种保存方法如下:
(1)斜坡低温保存法这是最简单也是最常见的保存方法。该菌株在合适的斜面培养基(PDA)上培养后，选择生长旺盛并保持边缘的菌丝体。一般贮藏温度为4 ~ 6℃，草菇和银耳除外(10 ~ 15℃)。该方法适用于其他食用菌。一般菌种可保存2 ~ 4个月，需要定期移植。这种方法虽然保存方便，但保存时间短，需要频繁换管，容易衰退和变异。所以不能用于长期保存，最好结合其他方法进行保存。
为了减少保存过程中培养基中水分的蒸发，最好添加琼脂至2.5%。为防止储存过程中酸的积累，应加入0.2%磷酸氢二钾、磷酸二氢钾等缓冲盐。同时，培养物成熟后，最好将棉塞外部切开，用矿物蜡密封或用无菌软木塞代替，这样也可以减少培养基中水分的流失，延长保存时间。
如果农村没有冰箱，可以用土办法保存。也就是把保藏用的斜面菌种换成无菌胶塞，用矿物蜡烛蜡密封，密封在密闭的罐子里，挂在井底保藏。(2)贮藏室保存法原种和栽培种一般只在贮藏室短期保存，贮藏室温度为0 ~ 10℃。室内应清洁、干燥、避光，并经常检查温度和湿度，以减少其活力、变异和降解，防止杂菌污染，避免过早出菇。温度越高，储存时间越短。
菌种保存的常用方法有哪些？
菌种保存是食用菌产业的一项基础工作，是保证野生种质资源基因保留和现有生产种遗传性状相对稳定的必要手段。菌种保存的方法很多，有些很有效，但投入高或操作复杂。在生产实践中，更需要用简单的方法保证菌种不死不污染，最大限度地保持优良菌种，如斜面低温短期保存和天然基质长期保存相结合。
一般来说，母种保存时间长，原种保存时间短。要保证优良菌株的特性和活力不发生变化、不死亡、不被污染，保证其纯度。因此，保存方法应具有取材容易、操作方便、菌种不易降解、长期保存后不被杂菌污染等优点。常用的菌种保存方法如下:
(1)这种方法的优点是存储方便，在空 空之间占用空间少。具体方法是将菌丝体用斜面覆盖，0 ~ 5℃保存。之后每隔一定时间(2 ~ 3个月)换一次管。PDA培养基不能长时间保存在旋转管中，否则物种容易退化，灰树花降解木质纤维素的能力减弱。所以每隔一段时间(一年左右)要将菌种转移到木屑培养基上复壮，然后挑选健康无污染的菌丝，转回PDA培养基上保存。在长期保存的过程中，要防止卫生棉条受潮，滋生杂菌。最好用蜡封住试管口，防止培养基中的水分蒸发过快。增加琼脂的用量(2.5% ~ 3%)可以减缓水分的蒸发。还要防止应变管上的标签脱落，造成菌种混合。
斜面冻存法简单易行，可随时观察保存菌株的活力和纯度。一旦被污染，肉眼就能及时发现。
(2)天然底物的保存该方法是根据灰树花的特性，利用天然底物保存灰树花菌种的方法。灰树花是一种木腐真菌，以木屑为主料的培养基即可。天然基质营养丰富，且多为缓释营养，不易产生营养过剩或饥饿感；培养基理化性质好，能吸收或缓冲菌丝代谢的有害物质，水分和通气和谐平衡。有些菌丝生长在不接触空气体的基质中，所以呼吸强度低，生命力强。
1.原料与粗、细木屑的配比合适，以板栗木屑为最佳。粗锯末的粒径在2 mm左右，细锯末是一般的圆盘状锯末。粗细比例1: 2，加20%麸皮和1%糖，含水量60%左右。这种基质透气性好，营养丰富，菌丝分解利用时间长。生长在基质内部的菌丝体比包裹在基质外部暴露在空气体中的菌丝体更耐受。适当比例的不同粒径的基质也可以协调气水矛盾。粗粒和空菌丝太多；细粒太多，透气性差，菌丝生长慢。应用公式如下:
将78%的板栗木屑、20%的麸皮、1%的石膏、1%的蔗糖和65%的水放入粗试管中，装载量为试管的1/3 ~ 1/2，1.5 kg/cm2，灭菌1.5小时。冷却后，接种待保存的菌种，28℃培养，待菌丝长满木屑培养基时取出放在无菌胶塞上，0 ~ 5℃冰箱保存1 ~ 2年。
2.容器和容积应为容量为250 ml的葡萄糖玻璃瓶，应清洗干净，容积一般不超过玻璃瓶容量的3/5。填充物不能太满，瓶壁上的残留颗粒要擦拭干净，否则保存下来的菌种容易造成污染。
3.如果用棉塞灭菌和冷藏灭菌，基质表层容易失水，接种成活率低。即使菌丝复活，它的生长也非常缓慢。所以最好用聚丙烯薄膜密封，接种后用无菌棉塞培养，菌丝饱满后再用打孔无菌胶塞冰箱保存。
经过三年的保存，用上述方法保存的菌株存活率在90%以上，蘑菇的验证产量和子实体的形态特征没有明显变化。因此，本发明具有保存期长、菌株遗传性能相对稳定的特点。
(3)保存在木质颗粒PDA坡面上的灰树花在自然状态下容易出现在栗树根部，说明其营养需求更为特殊。根据灰树花的习性，在PDA中添加适量的板栗颗粒制成母种培养基。经过多年使用，发现用这种培养基培养的母种生长势好，适应性强，转移原种时萌发定殖快。用作菌种保藏的基质，保藏时间长，能很好地保持菌种的优良特性。
1.木质PDA以板栗边材为原料，加工成0.3 ~ 0.5厘米的颗粒，及时晾干或晒干备用。称取10克葡萄糖和41克KH2PO，将1溶于1升清水中，制成营养液。将营养液倒入盛有木屑的小铝锅内，营养液要完全浸没木屑。煮沸10分钟加速木粒吸收营养液，让木粒吸收营养液30分钟。取出木粒，沥干表面水分，放入试管中。加载量为试管长度的1/6，但最多不超过试管长度的1/5。否则在放置斜面时，不容易使木材颗粒均匀分散在斜面表面。
选取新鲜土豆，去皮切成薄片，称200g，放入小铝锅内，加入1升清水，用文火煮30分钟，趁热过滤，补足1升的体积。称取20克琼脂、20克葡萄糖、2克磷酸二氢钾和2克硫酸镁47 H2O 2克。先将琼脂切成块，加入土豆滤液中，继续用文火加热，使琼脂溶解。琼脂完全溶解后，再加入其他三种营养物质，搅拌使这些物质溶解均匀，趁热放入有木块的试管中，放在试管长度1/3的地方，用棉塞塞住。
在0.8 ~ 1kg/cm2的蒸气压下灭菌40分钟，待蒸气压降至0时，取出试管，趁热轻轻摇动，使木粒分散放置在斜面上，使木粒半裸分布在斜面上。固化后，制得木材颗粒PDA培养基。
2.生长保存效果:在木质颗粒的PDA斜面上培养的灰树花菌丝体生长迅速，长势良好，12天即可装满试管，但菌丝体后期生长更加健壮、密集，后劲十足。该菌株适应性强，转到原种时定殖迅速。这说明灰树花菌丝体的生长速度和生长潜力不仅取决于其自身的遗传，而且很大程度上取决于培养基的营养。常规PDA的营养成分主要是可溶性速效营养，前期营养丰富，直接利用，所以前期菌丝长得快，长得好，后期不足，菌丝长得差，生长不良。由于在木颗粒的PDA中加入了木颗粒的缓效营养，就木腐灰树花而言，营养配伍合理，补充了菌丝生长后期所需的营养，后劲足。
基质通过菌丝体细胞分泌的胞外酶被菌丝体分解利用，然后被吸收利用。这些胞外酶多为诱导酶，其合成和分泌受基质诱导和分解产物阻遏机制的调控。就纤维素酶而言，许多可代谢的碳源(如葡萄糖等。)具有抑制酶合成的作用。同时，随着菌丝体的旺盛生长，在可代谢碳源基本耗尽后，出现了大量的酶合成，这是由基质纤维素诱导的。从常规的PDA底物到葡萄糖等可代谢碳源基本耗尽的后期，由于营养缺乏，菌丝体生理功能下降，酶合成量减少。木质颗粒PDA不仅含有葡萄糖这种易代谢的碳源，还含有木质颗粒的缓效营养。前期葡萄糖促进菌丝生长旺盛，获得大量菌丝，菌丝粗大。在易代谢碳源耗尽的后期，木颗粒一方面补充后期所需营养，使菌丝生长和埋藏功能维持在一定水平；另一方面，木材颗粒的纤维素激活了菌丝体细胞中纤维素酶的诱导机制，合成了大量的酶，保持了木材腐生灰树花较强的木材分解能力。因此，在该培养基中培养的母种适应性强，转移原种时萌发定殖快。由于部分菌丝长成木颗粒，对不良环境的生存能力增强，种质不易退化。灰树花菌种在0 ~ 5℃保存2 ~ 3年后，转移到试管中活化，存活率仍在90%左右。木质颗粒PDA在木腐灰树花种子纯化和复壮中的应用也是理想的。
(4)石蜡无氧保存的具体方法是将液体石蜡放入三角瓶中，灌装量达到瓶的1/3 [/K0/]，用棉塞塞紧，121℃灭菌2小时，然后放入40℃培养箱中蒸发水分，或放入干燥器中几天除去水分，以石蜡透明为宜。在无菌条件下，将一根无菌吸管放入有菌丝的倾斜试管中，使液面高出斜面顶部约1厘米。在上面放上无菌橡皮塞，垂直存放。这种方法可使菌株存活3年以上，但最好每隔1 ~ 2年移植一次。移栽时不用倒石蜡，用接种钩取一片菌丝体即可。因为转移中有石蜡，菌丝生长较弱，需要轮换一两次才能复壮。
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